Análisis de la respuesta metabólica involucrada en la optimización de condiciones de cultivo para incrementar la producción de proteí­nas heterólogas en la levadura metilotrófica pichia pastoris / Miguel Castillo Galván

Tesis (Doctor en ciencias con especialidad en biotecnologí­a) UANL , 2014

Incluye referencias bibliográficas.

P. pastoris es una levadura metilotrófica capaz de utilizar metanol como una sola fuente de carbono y energí­a y es ampliamente usada para la expresión de genes y producción de proteí­nas recombinantes con fines de investigación o industriales. En el presente trabajo, se utilizó una estrategia de diseño de experimentos (método de optimización Simplex) para optimizar cinco factores ambientales (temperatura, pH,concentración de metanol, densidad celular inicial y presencia de sorbitol) que definen las condiciones de cultivo en la etapa de inducción para aumentar la producción de la fitasa beta-propeller FTEII en cultivos de P. pastoris en biorreactor. Además, se determinó la correlación de este proceso de optimación con la actividad fisiológica y la expresión de genes del organismo huésped. Con el proceso de optimación, se alcanzaron hasta 347.682 U (82.814 U/L o 6,4 g/L del medio de cultivo) de fitasa a 68 h de la inducción.. Los resultados indican que el aumento en la producción de fitasa extracelular a través del proceso de optimización se correlaciona con un aumento en la actividad metabólica de P. pastoris, con una disminución de la actividad proteasas extracelulares, un aumento de secreción de la proteí­na recombinante alcanzando niveles de hasta en un 88%, y además un aumento de la eficiencia de la producción de fitasa extracelular por célula. El aumento de la producción de FTEII no se relacionó con la expresión del gen FTEII y el gen AOX2, sin embargo, este aumento podrí­a estar relacionado con un aumento de la eficiencia del proceso de traducción, postraducción o secreción de FTEII, argumentos apoyados por la expresión diferencial (nievles más altos) de los genes KAR2 y KEX2 y los genes de proteasas vacuolares (PEP4, PRB1, y PRC1) los cuales juegan un papel clave en la ví­a de secreción y procesos postraduccionales de proteí­nas de P. pastoris, además del aumento de una actividad metabólica para la generación de energí­a requerida en estos procesos. La información obtenida en el presente trabajo impacta directamente en el diseño de procesos más eficientes para la producción de proteí­nas recombinantes en P. pastoris aunado a la comprensión de la fisiologí­a del hospedero bajo las condiciones del proceso.